实验操作小课堂

• 1.问：血清出现沉淀怎么办？
• 答：血清解冻后出现少量沉淀属于正常现象，可在 4℃ 下离心（3000-5000rpm，10 分钟）后取上清使用。若沉淀较多或对实验有影响。
• 2.问：血清出现沉淀是什么？
• 答：纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到 1-2  mm，可以用肉眼观察到。磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在 37℃ 培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染；胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质，也是血清中常见的沉淀物。
• 3.问：血清使用前是否需要过滤？
• 答：不需要，产品生产工艺中有三次 0.1µm 滤膜过滤，使用前无需再进行相关操作。
• 4.问：如何确定血清的最佳添加比例？
• 答：不同细胞类型对血清的需求不同，建议通过预实验来确定最佳添加比例。一般可设置 5%、10%、15%、20% 等不同浓度梯度，观察细胞的生长状态和增殖情况，选择最适合的血清添加比例。
• 5.问：血清可以在室温下放置多久？
• 答：血清应尽量避免在室温下长时间放置，一般建议不超过 1 小时。若需在室温下操作，应尽快完成，操作完成后及时放回冰箱保存。
• 6.问：使用该血清时，细胞生长缓慢是什么原因？
• 答：可能是血清添加比例不当，可重新调整比例；也可能是细胞本身状态不佳、培养条件不合适，比如培养基成分、温度、CO₂ 浓度等需要排查。
• 7.问：冻存的血清发现有结冰膨胀甚至瓶子破裂的情况，还能使用吗？
• 答：如果瓶子破裂，血清暴露在外界环境，极有可能被污染，不建议使用；若瓶子未破，可检查血清外观、是否有异常沉淀等，通过预实验检测其对细胞生长的影响，再决定是否使用。
• 8.问：使用该血清培养细胞，细胞出现分化异常，是什么原因？
• 答：可能是血清中某些成分对该细胞的分化产生影响，可查阅文献了解血清成分与细胞分化的关系；也可能是实验过程中其他因素干扰，如细胞传代次数过多、添加了影响分化的试剂等。
• 9.问：不同批次的特级南美胎牛血清可以混用吗？
• 答：虽然产品批间差异小，但仍不建议混用不同批次血清。每批血清成分存在细微差别，混用可能导致细胞培养条件不稳定，影响实验结果的一致性。
• 10.问：不同牛血清的区别是什么？
• 答：（1）取血年龄不同：牛血清按照牛取血时间或牛龄可进行区分。胎牛血清（Fetal Bovine Serum，简称 FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹得来的胎牛。新生牛血清指的是出生 4-6 小时，且未进行哺乳进食的牛。小牛血清（简称 NBCS）指的是出生 14天到 3 个月，进行取血的牛血清。成年牛血清（简称 ABS）指的是取血时牛龄通常超过 12 个月的牛。以上取血牛龄的差异主要是受当地国家畜牧业的发展及法规限制影响，因为牛血多为畜牧业副产业，并未有专门为取血而养的牛。
  （2）组分与比例不同：这几种不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。常规来说，年龄越小的牛血清，细胞培养效果越好。胎牛血清培养效果好于新生牛，且因为胎牛未进食过母乳，所以 IgG 含量低。
• 11.问：为什么要进行热灭活FBS，有无必要？
• 答：热灭活是指 56ºC，30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中需有规则地摇晃均匀。加热可以灭活血清中的补体系统，使补体去活化。通常未灭活的补体能够刺激平滑肌收缩、肥大细胞和血小板组胺的释放、激活淋巴细胞和巨噬细胞，同时还能够参与溶解细胞的过程。但诸多研究表明大多数细胞的培养无须进行血清的热灭活。而在免疫学研究和ES细胞、昆虫细胞、平滑肌细胞的培养过程中，推荐使用热灭活血清。并且热处理过的血清，沉淀物明显增多，倒置显微镜下观察呈“小黑点”，往往会使研究者误以为是血清受到了污染，而把血清放于 37℃ 中，沉淀物又会增多，又会使研究者误认为是微生物的分裂增殖，因此，若非必须，建议不进行热处理。

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