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(2) 线性化载体或插入片段比例不佳。请严格按照说明书推荐的方法计算各组分用量，用琼脂糖 凝胶电泳检测样品质量以及浓度；
(3) EDTA 等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆实验；
(4) 胶回收制备，最后洗脱时需要用水洗脱，不能用TE buffer进行洗脱，用于重组反应的胶回 收产物要溶解于 ddH2O；
(5) 插入片段纯度差；
(6) 引物设计有误，设计时特别注意反向引物的序列顺序。
（2）目的片段投入过低，导致连接失败。
(2) 克隆载体及片段中含有质粒背景。克隆载体线性化不完全，酶切制备线性化载体时，要提高快速内切酶的使用量并延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物；制备插入片段时尽量⽤预线化质粒作为扩增模板，扩增产物进行 DpnⅠ 消化以及进行凝胶回收纯化；
(3) PCR 产物混有非特异扩增产物：优化 PCR 体系，提高特异性；胶回收 PCR 产物；鉴定更多的克隆。
(2) 挑斑方法不合适：重组产物 3' 端与 5' 端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；平板营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑，以增加挑到重组产物的概率；
(3) 菌检引物不合适：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液 PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。
(2) 分析测序结果：检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信；
(3) 检查突变位点：如果多个结果突变位点一致，可能是从模板上引入的或者模板序列与 NCBI 上不一致；
(4) 插入片段在 PCR 获得时建议使用高保真聚合酶；
(5) 若引物处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议重新合成引物进行实验。
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产品货号 |
M10701 |
M10702 |
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产品名称 |
One-Step Seamless Gold Cloning Kits |
One-Step Seamless Cloning Kits |
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规格 |
10 μL×50 T |
10 μL×20 T |
10 μL×50 T |
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稳定性 |
耐反复冻融 |
耐反复冻融、37 ℃可稳定保存一周以上 |
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插入片段适配性 |
适配1-5片段的重组，总质粒长度≤15 kb阳性率较高 |
适配多个复杂片段重组，可实现最多10个800 bp片段的连接 |
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One-Step Seamless Gold Cloning Kits
One-Step Seamless Gold Cloning Kits
1-5片段高效重组，彻底摆脱酶切位点限制，高效精准克隆
高效高阳性率：最快5 min内完成重组，阳性率超过98%，大幅缩短实验周期并保障结果可靠性；
多片段复杂组装：可一次完成1~5个片段的复杂重组，满足高效复杂构建需求；
载体与位点无限制：彻底摆脱酶切位点依赖，无需对插入片段进行酶切处理，可在任意载体的任意位点实现定向克隆；
极简操作：一管反应完成重组，步骤极简，省去酶切及酶切后切胶回收等多步骤；
产品稳定：经40次反复冻融后，重组克隆活性无明显下降。
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组分 |
10 μL×20 T |
10 μL×50 T |
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A. 2× Super Fusion Cloning Mix |
100 μL |
250 μL |
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B. Control Plasmid,linearized(Amp+,40 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
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C. 500 bp Control Fragment(20 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
过夜培养后，重组产物转化平板形成数百个菌落。
图1 重组产物转化平板
挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，经过琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到符合预期条带大小的基因片段。菌落PCR鉴定为阳性的菌落，可再将剩余菌液接种至含有适当抗生素的液体LB培养基中培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定，或直接进行一代测序。
图2 菌落PCR琼脂糖凝胶电泳检测
(2) 线性化载体或插入片段比例不佳。请严格按照说明书推荐的方法计算各组分用量，用琼脂糖 凝胶电泳检测样品质量以及浓度；
(3) EDTA 等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆实验；
(4) 胶回收制备，最后洗脱时需要用水洗脱，不能用TE buffer进行洗脱，用于重组反应的胶回 收产物要溶解于 ddH2O；
(5) 插入片段纯度差；
(6) 引物设计有误，设计时特别注意反向引物的序列顺序。
（2）目的片段投入过低，导致连接失败。
(2) 克隆载体及片段中含有质粒背景。克隆载体线性化不完全，酶切制备线性化载体时，要提高快速内切酶的使用量并延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物；制备插入片段时尽量⽤预线化质粒作为扩增模板，扩增产物进行 DpnⅠ 消化以及进行凝胶回收纯化；
(3) PCR 产物混有非特异扩增产物：优化 PCR 体系，提高特异性；胶回收 PCR 产物；鉴定更多的克隆。
(2) 挑斑方法不合适：重组产物 3' 端与 5' 端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；平板营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑，以增加挑到重组产物的概率；
(3) 菌检引物不合适：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液 PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。
(2) 分析测序结果：检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信；
(3) 检查突变位点：如果多个结果突变位点一致，可能是从模板上引入的或者模板序列与 NCBI 上不一致；
(4) 插入片段在 PCR 获得时建议使用高保真聚合酶；
(5) 若引物处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议重新合成引物进行实验。
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产品货号 |
M10701 |
M10702 |
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产品名称 |
One-Step Seamless Gold Cloning Kits |
One-Step Seamless Cloning Kits |
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规格 |
10 μL×50 T |
10 μL×20 T |
10 μL×50 T |
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稳定性 |
耐反复冻融 |
耐反复冻融、37 ℃可稳定保存一周以上 |
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插入片段适配性 |
适配1-5片段的重组，总质粒长度≤15 kb阳性率较高 |
适配多个复杂片段重组，可实现最多10个800 bp片段的连接 |
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| One-Step Seamless Cloning Kits | |||
| 多片段的复杂重组，彻底摆脱酶切位点限制，高阳性率 | |||
| 货号 | 规格 | 目录价 | 库存 |
| M10702 | 10 µL×20 T | 548.00元 | 100 |
| M10702 | 10 µL×50 T | 878.00元 | 100 |
