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One-Step Seamless Cloning Kits

产品货号 产品规格 目录价 库存 数量
M10702 10 µL×20 T ¥548.00 100
M10702 10 µL×50 T ¥878.00 100
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效能等同Clontech In-Fusion® Snap Assembly Master Mix
本文中In-Fusion®为Clontech的商标及注册商标

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实验操作小课堂

  • 1.问：转化效率低甚至是不长克隆都是由哪些原因造成的?
  • 答：(1)感受态细胞因为保存时间或者质量不佳会引起转化效率低下，建议使用新制备的感受态细胞或者质量上佳的感受态细胞；
    (2) 线性化载体或插入片段比例不佳。请严格按照说明书推荐的方法计算各组分用量，用琼脂糖凝胶电泳检测样品质量以及浓度；
    (3) EDTA等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆实验；
    (4) 胶回收制备，最后洗脱时需要用水洗脱，不能用TE buffer进行洗脱，用于重组反应的胶回收产物要溶解于 ddH2O；
    (5)插入片段纯度差；(6)引物设计有误，设计时特别注意反向引物的序列顺序。
  • 2.问：菌落PCR验证时为什么会出现大量空载体？
  • 答：（1）载体线性化不完全，没有完全切开；（2）目的片段投入过低，导致连接失败。
  • 3.问：多数克隆不含插入片段？
  • 答：（1）相同抗性质粒污染。PCR 扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐 Dpn I 消化，或者对扩增产物进行胶回收纯化。
    （2）克隆载体及片段中含有质粒背景。克隆载体线性化不完全，酶切制备线性化载体时，要提高快速内切酶的使用量并延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物；制备插入片段时尽量⽤预线化质粒作为扩增模板，扩增产物进行 DpnⅠ 消化以及进行凝胶回收纯化。
    （3）PCR 产物混有非特异扩增产物：优化 PCR 体系，提高特异性；胶回收 PCR 产物；鉴定更多的克隆。
  • 4. 问：假阳性/测序无信号/空载体？
  • 答：（1）质粒载体残留导致的假阳性：设置阴性对照来排查，如果阴性对照长了很多，可能是模板投入量过多或者未进行 Dpn I消化。若以质粒为模板 PCR 获得片段/载体：质粒投入量不宜过多（<1ng），否则可能导致 Dpn I消化不完全从而造成假阳性。建议 PCR 产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在 ddH2O 中。（2）挑斑方法不合适：重组产物3'端与5'端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；平板营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑，以增加挑到重组产物的概率。（3）菌检引物不合适：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液 PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。
  • 5. 问：插入片段出现碱基突变？
  • 答：（1）测序的样本数：如果只测了一个样本，不一定可信，需要多测几个样本；
    （2）分析测序结果：检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信；
    （3）检查突变位点：如果多个结果突变位点一致，可能是从模板上引入的或者模板序列与NCBI 上不一致；（4）插入片段在 PCR 获得时建议使用高保真聚合酶；
    （5）若引物处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议重新合成引物进行实验。
  • 问：公司有两款无缝克隆产品，该如何选择？
  • 答：我们的两款产品均为高效转化产品，可根据连接片段的不同进行选择：

    产品货号

    M10701

    M10702

    产品名称

    One-Step Seamless Gold Cloning Kits

    One-Step Seamless Cloning Kits

    规格

    10 μL×50 T

    10 μL×20 T

    10 μL×50 T

    稳定性

    耐反复冻融

    耐反复冻融、37 ℃可稳定保存一周以上

    插入片段适配性

    适配1-5片段的重组，总质粒长度≤15 kb阳性率较高

    适配多个复杂片段重组，可实现最多10个800 bp片段的连接

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One-Step Seamless Cloning Kits
One-Step Seamless Cloning Kits

多片段的复杂重组，彻底摆脱酶切位点限制，高阳性率

  • 储运条件 -20 ℃避光保存；冰袋运输
  • 产品简介

    无缝克隆是一种简单、快速并且高效的 DNA 定向无缝克隆技术，可快速将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。使用任意方式将载体进行线性化，在插入片段正/反向扩增引物 5' 端引入线性化载体的末端序列，使得 PCR 产物 5' 和 3' 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列（15 - 25 bp）。通过重组酶的作用使得具有重叠区域的片段和载体最快在 50℃ 5 min 内重组，完成无缝克隆，且克隆阳性率可达 95% 以上。

  • 应用范围 快速克隆，载体构建、基因合成、DNA定点突变、高通量克隆等
  • 产品特点

    高效高阳性率：最快5 min内完成重组，阳性率超过95%，大幅缩短实验周期并保障结果可靠性；

    多片段复杂组装：可一次完成多个片段的复杂重组，最多可同时连接10个800 bp的片段，满足高效复杂构建需求；

    载体与位点无限制：彻底摆脱酶切位点依赖，无需对插入片段进行酶切处理，可在任意载体的任意位点实现定向克隆；

    极简操作：一管反应完成重组，步骤极简，省去酶切及酶切后切胶回收等多步骤；

    高保真度：使用优化升级的DNA连接酶，保真度是普通酶的160倍以上，错配率低；

    产品稳定：配方升级优化，可抵御反复开盖氧化和干冰运输的影响，且37 ℃可稳定保存一周以上；

    转化效率高：增加转化增强剂，提升了转化子数量。

  • 产品组分

    组分

    10 μL×20 T

    10 μL×50 T

    A. 2×Super Fusion Cloning Mix

    100 μL

    250 μL

    B. Control Vector,Linearized(Amp+,40 ng/μL)

    5 μL

    5 μL

    C. 500 bp Control Fragment(20 ng/μL)

    5 μL

    5 μL

    注：50 T为试剂盒组分A进行10 μL反应体系的总数。
  • 结果判读

    过夜培养后，重组产物转化平板形成数百个菌落，阴性对照反应转化平板上的克隆数显著少于前者。

     

    图1 A重组产物转化平板 B阴性对照


    挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，经过琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到符合预期条带大小的基因片段。菌落PCR鉴定为阳性的菌落，可再将剩余菌液接种至含有适当抗生素的液体LB培养基中培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定，或直接进行一代测序。

     

    图2 菌落PCR琼脂糖凝胶电泳检测

    经过菌落PCR、质粒PCR或者提取质粒酶切后，经过琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到符合预期条带大小的基因片段。

    过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆，而阴性对照反应转化平板上的克隆数应显著少于前者。

  • 1.问：转化效率低甚至是不长克隆都是由哪些原因造成的?
  • 答：(1)感受态细胞因为保存时间或者质量不佳会引起转化效率低下，建议使用新制备的感受态细胞或者质量上佳的感受态细胞；
    (2) 线性化载体或插入片段比例不佳。请严格按照说明书推荐的方法计算各组分用量，用琼脂糖凝胶电泳检测样品质量以及浓度；
    (3) EDTA等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆实验；
    (4) 胶回收制备，最后洗脱时需要用水洗脱，不能用TE buffer进行洗脱，用于重组反应的胶回收产物要溶解于 ddH2O；
    (5)插入片段纯度差；(6)引物设计有误，设计时特别注意反向引物的序列顺序。
  • 2.问：菌落PCR验证时为什么会出现大量空载体？
  • 答：（1）载体线性化不完全，没有完全切开；（2）目的片段投入过低，导致连接失败。
  • 3.问：多数克隆不含插入片段？
  • 答：（1）相同抗性质粒污染。PCR 扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐 Dpn I 消化，或者对扩增产物进行胶回收纯化。
    （2）克隆载体及片段中含有质粒背景。克隆载体线性化不完全，酶切制备线性化载体时，要提高快速内切酶的使用量并延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物；制备插入片段时尽量⽤预线化质粒作为扩增模板，扩增产物进行 DpnⅠ 消化以及进行凝胶回收纯化。
    （3）PCR 产物混有非特异扩增产物：优化 PCR 体系，提高特异性；胶回收 PCR 产物；鉴定更多的克隆。
  • 4. 问：假阳性/测序无信号/空载体？
  • 答：（1）质粒载体残留导致的假阳性：设置阴性对照来排查，如果阴性对照长了很多，可能是模板投入量过多或者未进行 Dpn I消化。若以质粒为模板 PCR 获得片段/载体：质粒投入量不宜过多（<1ng），否则可能导致 Dpn I消化不完全从而造成假阳性。建议 PCR 产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在 ddH2O 中。（2）挑斑方法不合适：重组产物3'端与5'端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；平板营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑，以增加挑到重组产物的概率。（3）菌检引物不合适：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液 PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。
  • 5. 问：插入片段出现碱基突变？
  • 答：（1）测序的样本数：如果只测了一个样本，不一定可信，需要多测几个样本；
    （2）分析测序结果：检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信；
    （3）检查突变位点：如果多个结果突变位点一致，可能是从模板上引入的或者模板序列与NCBI 上不一致；（4）插入片段在 PCR 获得时建议使用高保真聚合酶；
    （5）若引物处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议重新合成引物进行实验。
  • 问：公司有两款无缝克隆产品，该如何选择？
  • 答：我们的两款产品均为高效转化产品，可根据连接片段的不同进行选择：

    产品货号

    M10701

    M10702

    产品名称

    One-Step Seamless Gold Cloning Kits

    One-Step Seamless Cloning Kits

    规格

    10 μL×50 T

    10 μL×20 T

    10 μL×50 T

    稳定性

    耐反复冻融

    耐反复冻融、37 ℃可稳定保存一周以上

    插入片段适配性

    适配1-5片段的重组，总质粒长度≤15 kb阳性率较高

    适配多个复杂片段重组，可实现最多10个800 bp片段的连接

    • 本资料源自公开学术渠道，如需转载或引用，请联系原文作者获取授权。本页面内容仅作学术参考，不代表任何商业推荐或合作。

    One-Step Seamless Gold Cloning Kits
    1-5片段高效重组，彻底摆脱酶切位点限制，高效精准克隆
    货号 规格 目录价 库存
    M10701 10 µL×50 T 968.00元 100
    摩尔浓度计算器 稀释计算器 分子量计算器
    质量   浓度   体积   分子量 *
    = × ×
    质量   浓度
    = ×
    体积   分子量 *
    ×
    浓度 (start) × 体积 (start) = 浓度 (final) × 体积 (final)
    × = ×
    浓度 (start) × 体积 (start) =
    × =
    浓度 (final) × 体积 (final)
    ×
    分子量：g/mol
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