Cell Analyze™ Autophagy Green Assay Kits（MDC）
Cell Analyze™细胞自噬绿色检测试剂盒（MDC法）
10 min零转染 一步点亮活细胞自噬体-自噬溶酶体 即刻可见
储运条件
组分A -20 ℃避光长期保存，避免反复冻融，其余组分4 ℃保存并以冰袋运输
产品简介
Cell Analyze™ Autophagy Green Assay Kits (MDC)是一款以单丹磺酰尸胺(MDC)为核心组分的细胞自噬荧光检测试剂盒，旨在解决传统自噬检测流程复杂、特异性低的痛点。其核心原理为嗜酸性染料MDC通过离子捕获效应与自噬体膜脂特异性结合，在活细胞内富集于自噬性囊泡并发出明亮绿色荧光，直观评估细胞自噬活性。相较于传统方法，本试剂盒无需转染、直接染色即可快速检测，且MDC靶向性强。注意：MDC可标记其他酸性细胞器，结果分析需设对照。细胞自噬与肿瘤、神经退行性疾病等密切相关，该试剂盒为生命科学与医学研究提供精准高效的技术支撑。
应用范围
活细胞状态实时观察自噬活性变化；无转染平台的常规自噬检测；药物、营养素、缺氧、氧化应激等条件对自噬活性筛查与半定量分析；与凋亡、坏死、细胞周期等联合研究
产品特点
实验快速：染色10 min即可成像，当天即可出结果，比传统转染法节省1-2天；
操作简便：无需转染，直接对活细胞染色，无需任何转染或稳转株构建；
适用性强：对难转染的细胞（如原代细胞）同样适用检测；
低毒实时：活细胞原位MDC染色，零固定/透化损伤，可连续追踪自噬动态；
高灵敏度：MDC嗜酸靶向自噬体/溶酶体，点状信号清晰可辨；
产品参数
Ex/Em：335 nm/512 nm；
产品组分
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组分
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100 T
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A. 10× MDC Stain
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1 mL
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B. Stain Buffer
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50 mL
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C. Wash Buffer
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100 mL
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注：100 T为试剂盒组分A进行96孔板荧光显微镜检测贴壁细胞时可检测的微孔总数。
结果判读
定性分析（显微镜）：
验证Ato能否促进OB-6细胞自噬，设置空白对照组、Dex组、Dex+Ato组排除单一成分干扰，其中Dex(1.0 μM)、Ato(0.1 μM)，经MDC探针孵育。在荧光显微镜下，细胞质中呈现绿色点状或囊泡状的荧光信号即为自噬体或自噬溶酶体，结果表明Ato可促进细胞自噬。
注：图片引自《Atorvastatin Upregulates microRNA-186 and Inhibits the TLR4-Mediated MAPKs/NF-κB Pathway to Relieve Steroid-Induced Avascular Necrosis of the Femoral Head. Front Pharmacol）（doi:10.3389/fphar.2021.583975.）
注：MDC是含有氨基的酸性染料，MDC亦可标记其它酸性细胞器，正常细胞存在基础背景荧光，结果分析时需设对照。
问：对于贴壁细胞，胰酶消化是必须的吗？胰酶消化多久算“不过度”？有没有更温和的替代方案？
答：是的，室温下0.25%胰酶30-60 s轻摇即可脱落，>2 min易诱导应激性自噬假阳性。
a.细胞刮刀：对于贴壁牢固的细胞，可以直接用细胞刮刀在冰上轻轻刮下，然后用缓冲液收集。此方法更温和，但可能得到一些细胞团块，需通过吹打或滤网（如40 μm细胞筛）制成单细胞悬液。
b.非酶解细胞分离液：市面上有基于EDTA或特殊缓冲液的细胞分离液，可以不依赖蛋白酶而使细胞脱落，对细胞表面结构影响更小，是研究自噬等细胞活动时的更优选择。
问：细胞在染色和洗涤过程中（尤其是贴壁细胞方案）大量脱落，该如何解决？
答：通常发生在细胞状态不佳或本就贴壁不牢的情况下（如诱导自噬后）。
a.事先加固：在接种细胞前，用多聚赖氨酸、鼠尾胶原或明胶溶液处理培养板/玻片表面，增强细胞的贴壁能力。
b.全程轻操作：所有加液、吸液动作务必轻柔，避免液体直接冲击细胞层。洗涤时，将液体沿孔壁缓慢加入，吸液时枪头尖端避开细胞层。
问：MDC染色时间（10-60 min）应该如何精确选择？
答：这是一个需要优化的参数。时间过短可能导致信号弱，时间过长则可能增加非特异性染色和背景。建议做法：在正式实验前，先用阳性对照细胞（EBSS饥饿处理）做一个时间梯度实验（如30,45,60,90,120 min设置5-6个时间点梯度），通过显微镜观察或流式检测，选择信噪比最高（即阳性信号最强，背景最低）的时间点作为后续实验的标准染色时间。
问：为什么流式细胞术方案中只洗涤1次，而显微镜方案要洗涤3次？
答：显微镜：是直接成像，任何残留的游离染料都会在视野中形成均匀的背景荧光，严重干扰对点状自噬体信号的观察。因此需要严格洗涤（3次）以最大化信噪比。
流式细胞仪：检测的是单个细胞通过激光时产生的瞬时荧光信号。仪器可以通过阈值设定，排除掉大部分游离染料颗粒（其大小和复杂度与细胞不同）。因此，1次洗涤通常足以去除大部分背景，同时能更好地保留已结合的MDC荧光信号，操作也更快捷。
问：流式上机前，用500 μL组分C重悬，这个体积是固定的吗？
答：不是固定的。这个体积的目的是获得一个适合上机检测的细胞浓度。
a.浓度过低：会导致上机时间过长，数据统计量不足。
b.浓度过高：容易造成细胞堵塞流式管路，且细胞重叠率增加，影响数据准确性。
c.建议：最终重悬后的细胞浓度应在2-5×10⁵ cells/mL左右。因此，如果起始细胞量是1×10⁵ 个，用500 μL重悬是合适的（即2×10⁵ cells/mL）。如果细胞量多，可相应增加重悬体积。
问：MDC染完能固定吗？
答：不建议用醛类固定，会淬灭荧光。MDC是与自噬体膜脂质弱结合的疏水探针，醛类固定剂会使膜蛋白交联、脂质重排，导致染料被“挤”出来，荧光强度下降30-70%。
a.固定后若再做通透（TritonX-100等），信号几乎消失。
b.固定液pH与渗透压不当，还会造成自噬泡肿胀或破裂，形态失真。
c.若必须固定，建议2-4%多聚甲醛（PFA），PBS配制，pH7.2-7.4；室温固定≤15 min；固定后立即PBS清洗3次，减少游离醛残留。
d.注意：固定完尽快（1 h内）上机或拍照，避免继续淬灭。
问：染色结果过强或过弱，可能是什么原因？如何调整？
答：染色过强通常是由于MDC染色时间过长，导致染料非特异性结合细胞内酸性结构（如溶酶体）。可适当缩短染色时间，并严格控制孵育时间，避免超时。染色过弱则可能由染色时间不足、MDC染色液因光照或存放过久发生淬灭（MDC对光极敏感，易分解）引起。可适当延长染色时间；染色液需现配现用，配制和存放时全程避光；若试剂盒存放超过保质期或出现颜色变化，建议更换新试剂盒。
问：阴性对照染色强度高，背景干扰大，该如何排查？
答：阴性对照染色强度高可能与操作步骤不规范（如洗涤次数不足、染色时间过长）或阳性对照设置不当有关。建议严格遵循洗涤步骤，确保MDC染色后至少洗涤3次或更多，以彻底清除残留染料。同时，核对检测仪器参数，确保激发波长应设置为335 nm（允许误差范围±10 nm），发射波长应设置为512 nm（允许误差范围±10 nm），若仪器无335 nm激发选项，可选择355 nm作为替代，但需注意背景可能略有升高；并设置阳性对照（如经EBSS诱导30 min-4 h的细胞）和空白对照，通过对比验证阴性对照的可靠性。
问：没有观察到预期的荧光，可能是什么原因？如何解决？
答：未观察到预期荧光可能与操作步骤错误、激发光设置不正确或阳性对照设置不当有关。建议仔细核对并确保激发光波长正确，严格按照操作步骤执行实验，并确认阳性对照的设置是否合理（如使用EBSS诱导的细胞）。
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