以活细菌和死细菌作为对照，分析计算样本中的活细胞数量。

1. 计算死、活细菌对照dCt

(1) qPCR实验结束后，用仪器自带软件计算每个样本的Ct值。

(2) 通过计算每个对照细菌的dCt来判断EMA是否成功抑制了死细菌DNA的扩增，计算如下：

dCt活=Ct（活, EMA 处理）－Ct（活, EMA 未处理）

dCt死=Ct（死, EMA 处理）－Ct（死, EMA 未处理）

(3) 活细菌dCt预期值接近0±1，这意味着EMA不会干扰活细胞DNA的扩增。

(4) 死细菌的dCt预期值大于4（dCt为4时，代表死细菌DNA减少约16倍，即去除了94%；dCt为8时，减少约250倍，即去除了99.6%）。

2. 计算活细菌占比

当死、活细菌对照结果无异常，即可开展样本中活细菌占比的计算。

(1) 样本dCt值的计算：

dCt样本=Ct（样本, EMA 处理）－Ct（样本, EMA 未处理）

(2) dCt值转换为活细菌比例：

EMA抑制倍数=2（样本dCt）

活细菌%=100/EMA抑制倍数

3. 活细菌绝对数量的计算

若要计算样本中活细菌的绝对数量，需用已知数量的目标菌基因组DNA绘制标准曲线。建议将几组基因组浓度稀释至qPCR分析体系的有效范围内。

(1) 制作标准曲线，细胞数为横坐标，Ct值为纵坐标。

(2) 实验样本拷贝数的计算：

Ct=斜率*细胞数+y轴截距(y=mx+b)

细菌数样本=（Ct－y轴截距）/斜率

示例：下图，活/死大肠杆菌用25 μM EMA孵育后光解处理，然后提取gDNA，采用uidA引物进行扩增。

注：建议先对引物及qPCR程序的适用性进行验证。 

注：死细菌的dCt受多种因素影响，包含菌株系/细胞类型、细菌致死方式、EMA使用浓度以及扩增序列长度。 

注：纯化过程中活细菌DNA未损失。 

注：因不同仪器不同菌群检测结果会有差异，此结果仅供参考。